Все методы иммунодиагностики можно разделить на неспецифические (направленные на характеристику состояния различных компонентов системы иммунитета: макрофагов, комплемента, гранулоцитов и др.) и специфические (направленные на выявление иммунных Т-лимфоцитов, различных аутоантител и антигенов). Для ревматологии наибольшее значение имеют специфические иммунологические методы.
Существует также деление иммунологических тестов на «функциональные», когда количественный подсчет антител основан на их биологической активности, и иммунометрические, основанные на количественном определении антител в составе иммунных комплексов. Недостаток функциональных тестов состоит в их низкой воспроизводимости, достаточной трудоемкости и сложности стандартизации. Примером функционального теста является определение АНА с помощью обнаружения LE-клеток («волчаночных» клеток). Данный метод, безусловно, уступает по аналитическим характеристикам и воспроизводимости методу определения АНА путем непрямой иммунофлуоресценции (НИФ) (иммунометрический тест).
Широко употребляемым термином в клинической практике является «иммунный статус», который необходимо понимать как состояние системы иммунитета обследуемого пациента (здорового человека) в конкретных окружающих его условиях.
Оценка иммунного статуса проводится на основании комплекса показателей, характеризующих состояние системы иммунитета. Оценка иммунного статуса включает характеристику клеточного и гуморального иммунитета.
Первым этапом обследования является общий анализ крови, в котором обращают внимание на количество форменных элементов (лейкоцитов разных типов: нейтрофилов, базофилов, эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов). Нормальное содержание лейкоцитов составляет 4-9х109/л. При аутоиммунной патологии определяющим фактором является характеристика лимфоцитов. Общее количество лимфоцитов составляет 20-36% от всех лейкоцитов, а в абсолютном выражении примерно 2000 клеток в 1 мм3 крови. Содержание Т-лимфоцитов составляет 50-70% от общего количества лимфоцитов или 1000-1400 клеток в 1 мм3 крови. Самым простым методом подсчета количества Т-лимфоцитов является реакция розеткообразования с эритроцитами барана. Более точные результаты получают при проведении РИФ с использованием меченных моноклональных антител к СD-антигенам (СD2, СD3). Далее оценивают содержание Т-хелперов и Т-супрессоров с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тc) антигенам. Содержание Т-хелперов в норме составляет 33-45%, Т-супрессоров – 17-25%. Определяется также иммунорегуляторный индекс (ИРИ), представляющий собой соотношение Тx/Тc. У здорового человека ИРИ составляет 14-2,0. При ревматических заболеваниях, как правило, наблюдается увеличение ИРИ. Одной из характеристик Т-лимфоцитов является их способность к синтезу различных цитокинов (интерлейкинов), содержание которых в биологических жидкостях оценивают методом ИФА. Функциональными характеристиками Т-лимфоцитов являются также пролиферативная активность (оценивается с помощью реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)) и цитотоксическая активность.
Для оценки содержания В-лимфоцитов используют моноклональные антитела к антигенам СD19-СD22, СD72. У здорового человека В-лимфоциты составляют 17-25% от количества всех лимфоцитов или в абсолютном выражении 600-800 клеток в 1 мм3 крови. К функциональной характеристике В-лимфоцитов относится продукция ими иммуноглобулинов. Характеристика системы гранулоцитов и моноцитов подразумевает определение количества различных лейкоцитов, оценку поглотительной (фагоцитарное число и фагоцитарный индекс), переваривающей способности фагоцитов (по количеству выросших колоний из лизатов лейкоцитов, участвовавших в фагоцитозе), метаболической активности (в реакции с нитросиним тетразолием).
Фагоцитарное число представляет собой среднее количество частиц (микроорганизмов) в одном фагоците. Нормальное значение для одного стафилококка составляет 6-12 частиц (микроорганизмов).
Фагоцитарный индекс – это количество фагоцитов, участвующих в фагоцитозе (имеющих поглощенные частицы (микроорганизмы)). У здорового человека фагоцитарный индекс равняется 60-80%.
На гранулоцитах и моноцитах возможно определение антигенов СD14, СD11, СD18, HLA-DR и др., выявление рецепторов к иммуноглобулинам и компонентам комплемента. Оценивается их способность к синтезу цитокинов, к хемотаксису.
Специфические методы иммунодиагностики базируются на методах выявления антител (иммуноглобулинов), иммунных Т-лимфоцитов и методах выявления антигенов.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) используется для выявления АНА, АНЦА, антител к ДНК, антител к центромере, АФЛ, антиперинуклеарных антител, антител к митохондриям и др. Данный метод подразделяется на прямую и непрямую (НИФ) иммунофлуоресценцию. Прямой метод РИФ основан на свечении антигенов, обработанных сывороткой, содержащей определенные антитела, меченные флуорохромами, или на свечении антигенов при связывании с антителами, мечеными флюорохромом, в люминесцентном микроскопе. В качестве флуорохрома чаще всего используют флюоресцеина изотиоционат (ФИТЦ). Прямая иммунофлюоресценция наиболее широко применяется в морфологических исследованиях биопсийного материала (биопсия кожи, почек и др.), цитологических, микробиологических исследованиях.
НИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью сыворотки против первично связанных антигеном антител, меченной флуорохромом.
НИФ может использоваться для выявления, как антигенов, так и антител, т.е. является серологическим методом иммунодиагностики. Поскольку аутоантитела могут связываться с различными структурами субстрата (например, к антигенам хроматина, ядрышка, митохондрий и т.д.), то и типы свечения в люминесцентном микроскопе могут быть разные. Возможны ситуации, когда одновременно выявляются несколько типов свечения, что свидетельствует о наличии нескольких разновидностей антител одновременно. Основным субстратом для проведения НИФ является перевиваемая клеточная линия НЕр-2. Метод иммунофлюоресценции является важным в ревматологии, он может быть использован как скрининговый, позволяет выявлять одновременное присутствие нескольких разновидностей антител. Однако существует определенная субъективность учета результатов теста, напрямую зависящая от квалификации исследователя.
Реакция агглютинации основана на склеивании антигенов в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), с антителами и выпадении образовавшегося комплекса в осадок.
Различают микробную агглютинацию (если в качестве диагностикума используют микробы), гемагглютинацию (с эритроцитами), латекс-агглютинацию (с частицами латекса) и др. Агглютинация может быть прямой, когда в реакции антитела агглютинируют антигены непосредственно. Реакция прямой агглютинации используется для выявления микробных антигенов, а также для определения групп крови. При проведении реакции непрямой (пассивной) агглютинации антиген адсорбируется на носителе (латекс, полистерол и др.). В реакции пассивной гемагглютинации в качестве антигенного носителя выступают эритроциты.
В ревматологии реакция непрямой агглютинации чаще всего используется для обнаружения РФ. Данная реакция основана на выявлении антител сыворотки крови пациента с использованием антигенного диагностикума (эритроциты или частицы латекса с адсорбированными на них антигенами). Результатом взаимодействия антител с антигенами является выпадение осадка. В ходе данного исследования наличие антител можно определить качественно или указать их титр. В последнем случае необходимо добавлять диагностикум в пробирки с разведениями сыворотки крови пациента. Для обнаружения РФ могут использоваться также методы нефелометрии и турбидиметрии. Чаще всего при этом определяют IgM РФ. Однако перечисленные методы по аналитическим характеристикам уступают ИФА.
Реакция преципитации используется для выявления антител к экстрагируемым ядерным антигенам (антитела к Sm, U1- рибонуклеопротеинам, Ro/SSA, La/SSB, Scl-70, Jo-1), склеродермических антител (антител к Scl-70), антинуклеолярных антител (антитела к РМ- Scl, U3-рибонуклеопротеинам, Th/To и др.), миозит-специфических антител (антител к аминоацилсинтетазам т-РНК (Jo-1), Mi-2, PM-Scl, KJ и др.). В реакции участвуют растворимые антигены - преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.
Наиболее часто используются такие варианты реакции преципитации как двойная иммунодиффузия по Оухтерлони в геле и иммуноэлектрофорез (комбинация метода электрофореза и иммунопреципитации).
Реакция преципитации по Манчини основана на иммунодиффузии в геле и используется для определения содержания различных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови. Метод двойной иммунодиффузии в геле и иммуноэлектрофорез отличаются простой и экономичностью, но обладают невысокой чувствительностью. На преципитации основаны методы нефелометрии и турбидиметрии.
Радиоиммунный анализ используется для определения АНА, антител к дезоксирибонуклеопротеину, антител к гистонам. Этот метод основан на реакции антиген-антитело, при этом один из компонентов взаимодействия метится радионуклидом. В качестве радиоактивного изотопа чаще всего используются изотопы йода (125I или 131I). Радиоактивность образовавшегося комплекса, определяемая при помощи счетчика, прямо пропорциональна количеству связавшихся антигенов и антител.
Иммуноферментный анализ (ИФА) используется для обнаружения антител к двухспиральной ДНК, антител к гистонам, антихроматиновых антител, антител к дезоксирибонуклеопротеину, антител к Sm (Smith) антигену, антител к рибонуклеопротеинам, антител к SS-A/Ro (Robert), антител к SS-B/La (Lane), антител к Scl-70, миозит-специфических антител, РФ, антител к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП антител), АФЛ антител, АНЦА и др.
Как видно, ИФА является одним из самых востребованных методов иммунологической лабораторной диагностики ревматических заболеваний. ИФА основан на выявлении антигенов или антител с помощью ферментов – меток (чаще используется пероксидаза хрена, бета-галактозидаза, щелочная фосфатаза). После того как произойдет взаимодействие между антигеном и антителом, меченным ферментом, в реакционную смесь добавляется смесь субстрата с хромогеном (например, перекись водорода + тетраметилбензидин), при этом происходит расщепление субстрата ферментом, приводящее к изменению окраски реакционной смеси. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству прореагировавших антигенов и антител. ИФА является одним из основных методов иммунодиагностики, используемых в ревматологии. Претензии к данному методу чаще всего связаны с его недостаточно высокой специфичностью при удовлетворительных показателях чувствительности. В сыворотке крови параллельно с высокоаффинными антителами присутствуют полиспецифичные антитела, конкурирующие с высокоспецифичными за связывание с антигеном. Необходимо учитывать также, что уровень антител к биологических жидкостях зависит от многих факторов как самого организма, так и от внешних воздействий. При неудовлетворительном качестве субстрата – антигена, иммобилизированного на полистирол (например, при присутствии бактериальных компонентов), создаются условия для взаимодействия антител с примесями к субстрату, что приводит к ложноположительным результатам реакции. В то же время при очистке антигена может произойти изменение его белковой структуры, что приводит к взаимодействию с неспецифичными антителами.
Наибольшую эффективность ИФА имеет при использовании тест-систем на основе сэндвич-технологии (ELISA). В данном случае на полистироле планшеты антигены фиксируются с помощью моноклональных антител.
Иммуноблотинг может использоваться для выявления антител к Sm (Smith), антител к рибонуклеопротеином, антител к Scl-70, антител к центромере, антител к SS-A/Ro (Robert), антител к SS-B/La (Lane), антинуклеолярных антител (аPM/Scl), миозит-специфических антител. Иммуноблотинг основан на сочетании электрофореза и ИФА. Данный метод является наиболее чувствительным и специфичным для анализа антигенной специфичности антител. В основе метода лежит электрофорез антигенов в полиакриламидном геле с последующим перенесением (блоттингом) на нитроцеллюлозную мембрану белкового материала, фракционированнного в соответствии с зарядом и маасой антигенов. После этого мембрана блокируется индифферентным белком для предотвращения неспецифического связывания антител. Далее мембрана с нанесенными белками инкубируется с сывороткой, содержащей антитела. После связывания антител с соответствующими мишенями, комплексы антиген-антитело выявляются с помощью античеловеческой сыворотки, меченной ферментом. На последнем этапе фермент-содержащие комплексы визуализируют с помощью ферментного субстрата, окисление которого проводит к образованию нерастворимых, окрашенных продуктов ферментативной реакции в месте расположения комплексов.
Иммунологическое обследование является неотъемлемым компонентом диагностического процесса в ревматологии. Избранные для каждого конкретного пациента методы иммунодиагностики должны быть адекватными, а качество их выполнения безупречным. Только при выполнении данных условий будет обеспечена высокая диагностическая эффективность иммунологического обследования.